類器官 Mouse Intestinal Organoid Kit類器官（Organoids）是指將成體干細胞或多能干細胞在體外三維培養(yǎng)形成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的組織類似物。類器官在組織結(jié)構(gòu)、細胞類型、自我更新能力和功能等方面與來源組織高度一致，從而在發(fā)育生物學、疾病造模、精準醫(yī)學、藥物研發(fā)、基因和細胞療法、感染和免疫以及再生醫(yī)學等生物醫(yī)學的多個領(lǐng)域展現(xiàn)出*的優(yōu)勢。

產(chǎn)品介紹

bioGenous^TMMouse Intestinal Organoid Kit（小鼠小腸類器官試劑盒）是一款用于建立和維持小鼠腸道成體干細胞來源小腸類器官的*培養(yǎng)基。生長在該*培養(yǎng)基中的小鼠小腸類器官主要由干細胞、腸祖細胞和腸絨毛細胞、潘氏細胞、杯狀細胞和少量腸內(nèi)分泌細胞組成，在自我更新能力、組織結(jié)構(gòu)、細胞類型和功能方面，小鼠小腸類器官重現(xiàn)了體內(nèi)小腸上皮的特征，因此是腸道穩(wěn)態(tài)和疾病機制研究的理想體外模型。

技術(shù)參數(shù)產(chǎn)品信息:

小鼠小腸類器官*培養(yǎng)基的制備：
使用無菌操作技術(shù)配制小鼠小腸類器官*培養(yǎng)基。以下是準備10mL*培養(yǎng)基的示例，如所需量不同，可相應(yīng)調(diào)整用量。

1.       冰上解凍Mouse Intestinal Organoid Supplement B (50x)和Mouse Intestinal Organoid Supplement C (250x)。
注意：解凍后，建議將Mouse Intestinal Organoid Supplement B (50x)和Mouse Intestinal Organoid Supplement C (250x) 分別分裝后保存取用，避免反復凍融。
2.       將200uL Mouse Intestinal Organoid Supplement B (50x)，40uL Mouse Intestinal Organoid Supplement C (250x)加至9.76mLMouse Intestinal Organoid Basal Medium中，充分混合，配制成10mL小鼠小腸類器官*培養(yǎng)基。
注意：配制后的小鼠小腸類器官*培養(yǎng)基可在2-8°C儲存，建議在兩周內(nèi)使用。Mouse Intestinal Organoid Supplement B(50x)內(nèi)含有細菌及真菌抗生素(50x)。
小鼠小腸類器官原代培養(yǎng)
1.       依據(jù)所在單位批準的實驗動物倫理及操作規(guī)范犧牲小鼠。
2.       準備若干培養(yǎng)皿，加入4℃預冷的DPBS備用。
3.       標準手術(shù)操作取小鼠小腸，根據(jù)實驗需求取總長度約3厘米至20厘米的小腸段，置于含DPBS的培養(yǎng)皿中。
4.       使用移液管或者注射器往小腸一端注入DPBS以沖洗腸內(nèi)容物，沖洗后置于新的含DPBS的培養(yǎng)皿中，重復沖洗數(shù)次至內(nèi)容物*被沖洗干凈，置于新的含DPBS的培養(yǎng)皿中。
5.       使用手術(shù)-剪將腸管剪開，腸腔面朝上，一只手使用手術(shù)-鑷夾住腸組織一端，另一只手使用手術(shù)-刀片輕輕刮去腸腔表面腸絨毛，待腸絨毛被刮凈后，將腸組織置于新的含DPBS的培養(yǎng)皿中清洗，重復清洗一次。
6.       將清洗后的小腸組織全部剪碎至2mm寬，并轉(zhuǎn)移至含有5mmol/L EDTA的預冷DPBS中消化，置于4℃孵育30min。
7.       消化完成后，將組織碎片轉(zhuǎn)移到新的含DPBS的培養(yǎng)皿中清洗，重復一次以去除EDTA。
8.       用5mL移液管在含冷的DPBS的培養(yǎng)皿或50mL離心管中吹打、重懸組織碎片，使組織反復穿過移液管尖以產(chǎn)生機械剪切力從而使隱窩與基底層分離，取一部分懸液鏡檢，當可以看到大量的隱窩樣結(jié)構(gòu)后，停止吹打，并對吹打后的組織懸液進行70μm濾網(wǎng)過濾。
9.       收集穿過濾網(wǎng)的組織懸液，150g離心力4℃離心3min。
10.    棄上清，使用1mLDPBS重懸組織沉淀，取20uL懸液進行鏡檢和隱窩計數(shù)，計數(shù)完成后吸取包含所需隱窩量的懸液，150g離心力4℃離心3min，棄上清后置于冰上。
11.    用適量的 Matrigel重懸組織沉淀，推薦重懸密度為每10uL Matrigel懸液包含200至600個隱窩，重懸后置于冰上，重懸時間不超過30s以避免Matrigel過早凝固。
注意： Matrigel 稀釋比例應(yīng)在70%以上以保證培養(yǎng)過程中Matrigel的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。
12.    將Matrigel和組織細胞的混合懸液點入24孔板底部正中央，每孔30uL左右，避免懸液接觸孔板側(cè)壁。
注意：為防止Matrigel室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。
13.    將接種完成后的培養(yǎng)板至于37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育15min左右待Matrigel凝固。
14.    配制小鼠小腸類器官*培養(yǎng)基。
15.    待Matrigel*凝固后，加入已配制好的小鼠小腸類器官*培養(yǎng)基，24孔板每孔500uL。
注意：請沿壁緩慢加入，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。
16.    將24孔板置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
17.    每 3 天更換一次培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)基時應(yīng)避免破壞Matrigel。
18.    密切監(jiān)測類器官生長狀態(tài)，理想情況下，小鼠小腸類器官應(yīng)在5至7天內(nèi)建成。
小鼠小腸類器官傳代培養(yǎng)
19.    用經(jīng)過Anti-Adherence Rinsing Kit (E238002)潤洗的槍頭吹打刮取類器官，并將類器官和培養(yǎng)基的懸液轉(zhuǎn)移至經(jīng)過Anti-Adherence Rinsing Kit潤洗的1.5mL EP管中。
20.    用經(jīng)過Anti-Adherence Rinsing Kit潤洗的槍頭用力重懸類器官懸浮液，使得類器官與Matrigel分離。
21.    150g離心力4℃離心3min，棄上清，使用DPBS重懸底部類器官沉淀，150g離心力4℃再次離心3min，棄上清后置于冰上。
22.    用適量的 Matrigel重懸類器官沉淀，重懸后置于冰上，重懸時間不超過30s以避免Matrigel過早凝固。
注意： Matrigel 稀釋比例應(yīng)在70%以上以保證培養(yǎng)過程中Matrigel的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。
23.    將Matrigel和類器官的混合懸液點入24孔板底部正中央，避免懸液接觸孔板側(cè)壁，每孔30uL左右。
注意：為防止Matrigel室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。
24.    將接種完成后的培養(yǎng)板至于37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育15min左右待Matrigel凝固。
25.    配制小鼠小腸類器官*培養(yǎng)基。
26.    待Matrigel*凝固后，加入已配制好的小鼠小腸類器官*培養(yǎng)基，24孔板每孔500uL。
27.    將24孔板置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

類器官 Mouse Intestinal Organoid Kit